Tebliğ Sağlık
Bakanlığından: Kozmetik Ürün
Bileşimlerinin Kontrolü İçin Gerekli Analiz
Yöntemleri Hakkında Tebliğ Tebliğ
No:İEG-2005/6
Amaç
Madde 1- Bu Tebliğin amacı,
benzoik asit, 4-hidroksibenzoik asit, sorbik asit, salisilik asit ve
propionik asit tanı ve tayini, hidrokinon, hidrokinon monometileter,
hidrokinon monometileter ve hidronon monobenzileter tanı ve tayini
konularındaki analiz yöntemleri ile
ilgili usul ve esasları belirlemektir. Kapsam
Madde 2- Bu
Tebliğ, aşağıdaki analiz metodlarının uygulamalarını kapsar: a)Benzoik asit,
4-hidroksibenzoik asit, sorbik asit, salisilik asit ve propionik asit tanı ve
tayini EK’teki Yöntem I’e göre yapılır. b)Hidrokinon, hidrokinon
monometileter, hidrokinon monometileter ve hidronon monobenzileter tanı ve
tayini EK’teki Yöntem II’ye göre yapılır.
Hukuki Dayanak
Madde 3 - Bu Tebliğ, 23/5/2005
tarihli ve 25823 sayılı Resmi Gazete’de yayımlanan Kozmetik Yönetmeliği’nin
16 ncı maddesine dayanılarak hazırlanmıştır. Uyumlaştırılan Avrupa Birliği Mevzuatı Madde 4- Bu
Tebliğ, 95/32/EEC sayılı Kozmetik Ürün Bileşimlerinin Kontrolü İçin Gerekli Analiz Yöntemleri Hakkında Altıncı Komisyon
Direktifi dikkate alınarak, Avrupa Birliği mevzuatına uyum kapsamında
hazırlanmıştır. Bu Tebliğ, laboratuarların denenmiş ve bilimsel geçerliliği
olan yöntemleri kullanmasını engellemez. Yürürlük Madde 5-
Bu Tebliğ yayımı tarihinde yürürlüğe girer. Yürütme Madde 6- Bu
Tebliğ hükümlerini Sağlık Bakanı yürütür. EK YÖNTEM I- KOZMETİK ÜRÜNLERDE BENZOİK ASİT,
4-HİDROKSİBENZOİK ASİT,SORBİK ASİT, SALİSİLİK ASİT VE PROPİYONİK ASİT TANI VE
TAYİNİ
1. KAPSAM VE UYGULAMA ALANI Bu metod benzoik asit,
4-hidroksibenzoik asit, sorbik asit, salisilik asit ve propiyonik asidin
kozmetik ürünlerde tanı ve tayini için uygulanır. Bu koruyucuların
tanımlanması için ayrı prosedürler verilmiştir. Propiyonik asit tayini ve
4-hidroksibenzoik asit, salisilik asit, sorbik asit, benzoik asit tayini. 2. TANIM Bu metod ile benzoik asit,
4-hidroksibenzoik asit, sorbik asit,
salisilik asit, ve propiyonik asit miktarı serbest asitlerin yüzde
kütlesi olarak ifade edilir. A. TANI
1. PRENSİP Koruyucuların asit /
baz ekstraksiyonundan sonra ekstrakt ince tabaka kromatografisiyle (türevlendirme
ile) analizlenir. Sonuçlara göre tanılar yüksek basınçlı sıvı kromatografi
(HPLC) ile veya propiyonik asitte olduğu gibi gaz kromatografisi (GC) ile
doğrulanır. 2. REAKTİFLER 2.1.
Genel Bütün çözeltiler analitik
saflıkta olmalıdır. Kullanılan su damıtılmış su veya en az eşdeğer bir
saflıkta olmalıdır. 2.2.
Aseton 2.3.
Dietileter 2.4.
Asetonitril 2.5.
Toluen 2.6.
n-hekzan 2.7.
Sıvı parafin 2.8.
Hidroklorik asit 4 M 2.9.
Potasyum hidroksit, sulu, 4 M 2.10.
Kalsiyum klorür, CaCl2.2H2O 2.11.
Lityum karbonat Li2CO3 2.12.
2-bromo-2-asetonafton 2.13.
4-hidroksi benzoik asit 2.14.
Salisilik asit 2.15.
Benzoik asit 2.16.
Sorbik asit 2.17.
Propionik asit 2.18.
Referans solüsyonlar Beş
koruyucunun (2.13-2.17) dietil eterde % 0.1’lik (m/v) solüsyonları (100
mg/100 ml) hazırlanır. 2.19.
Türevlendirme reaktifi 2-bromo-2’-asetofenon’un
(2.12) asetonitril (2.4) içindeki % 0.5’lik (m/v) solüsyonu (50 mg/10 ml). Bu
solüsyon haftalık hazırlanır ve buzdolabında saklanır. 2.20.
Katalizör solüsyon Lityum
karbonatın (2.11) suda % 0.3’lük (m/v) solüsyonu (300 mg/100 ml). Bu solüsyon
taze hazırlanmalıdır. 2.21.
Yürütme solvanı Toluen (2.5) / aseton
(2.2) (20:0.5, v/v) 2.22.
Sıvı parafin (2.7) / n-hekzan (2.6) (1:2, v/v) 3.
DÜZENEK Normal laboratuvar
düzenekleri 3.1.
Su banyosu, 60oC’de tutulabilen 3.2.
Yürütme tankı 3.3.
Ultraviyole ışık kaynağı, 254 ve 366 nm 3.4.
İnce tabaka plakları Kieselgel 60, floresans indikatörü
olmayan 20 x 20 cm, kaplama kalınlığı 0.25 mm. 2.5 x 20 cm’lik konsantre
edici alan ile (Merck 11845 veya eşdeğeri) 3.5.
Mikro şırınga, 10 µl 3.6.
Mikro şırınga, 25 µl 3.7.
Etüv, 105oC’ye kadar ısınabilen 3.8.
Vidalı kapaklı 50 ml.lik cam tüp 3.9.
Filtre kağıdı, çap 90 mm, Schleicher & Schull,
Weissband No 5892 veya eşdeğeri 3.10.
Universal pH indikatör kağıdı, pH 1-11 3.11.
5 ml cam örnek şişeleri 3.12.
Döner evaporatör (Rotavapor veya eşdeğeri) 3.13.
Isıtıcı tabla 4.
İŞLEM 4.1.
Örnek hazırlama Yaklaşık 1 gr örnek
vidalı kapaklı (3.8) 50 ml.lik tüp içine tartılır. Dört damla 4 M hidroklorik
asit (2.8) ve 40 ml aseton (2.2) ilave edilir. Tuvalet sabunları gibi
kuvvetli bazik ürünler için 20 damla hidroklorik asit 4 M (2.8) ilave
edilmelidir. İndikatör kağıdı (3.10) kullanılarak pH’ın yaklaşık 2 olduğu
kontrol edilir. Tüp kapatılır ve bir dakika süre ile şiddetlice çalkalanır. Koruyucuların aseton
fazına geçişini kolaylaştırmak, likit fazı eritmek için karışım dikkatlice 60oC’ye
ısıtılır. Solüsyon oda ısısına
kadar soğutulur ve filtre kağıdı ile (3.9) erlene süzülür. Filtratın 20 ml’si 200
ml.lik erlene alınır, 20 ml su eklenip karıştırılır. 4 M Potasyum hidroksit
(2.9) ile karışımın pH’sı 10 civarına pH kağıdı (3.10) ile ayarlanır. 1 gr kalsiyum klorür
(2.10) eklenir ve şiddetle çalkalanır. 75 ml dietil eter (2.3) içeren 250
ml.lik ayırma hunisine süzülerek alınır ve bir dakika şiddetle çalkalanır.
Ayrılmaya bırakılır, sulu faz 250 ml.lik erlene aktarılır. Eter tabakası
atılır. İndikatör kağıdı (3.10) kullanılarak, sulu solüsyonun pH’sı 2
civarına 4 M hidroklorik asit (2.8) ile ayarlanır. 10 ml dietil eter (2.3)
eklenir, erlenin ağzı kapatılarak 1 dakika şiddetle çalkalanır. Ayrılması
beklenir ve eter tabakası döner evaporatöre (3.12) aktarılır. Sulu kısım
atılır. Eterli faz hemen hemen
kuruluğa kadar uçurulur ve kalıntı 1 ml dietil eter (2.3) içinde çözülür,
solüsyon örnek şişesine (3.11) alınır. 4.2.
İnce tabaka kromatografisi Kromatografi
uygulanacak her referans ve örnek için, TLC plağına 3 µl lityum karbonat
çözeltisi (2.20), mikro şırınga (3.5) ile uygulanır. Plak soğuk hava altında
kurutulur. TLC plağı ısıtıcı tabla
(3.13) üzerine alınıp, 40oC’ye ısıtılır. Mikro şırınga (3.5) ile
10 µl referans solüsyon (2.18) ve örnek solüsyon (4.1) plağa lityum karbonat
damlatılmış olan yerlerin tam üzerine gelecek şekilde damlatılır. Son olarak yaklaşık 15
µl türevlendirme reaktifi (2.19) (2-bromo-2’-asetonafton solüsyonu), aynı
noktalar üzerine tatbik edilir. TLC plağı 45 dakika
süre ile 80oC’lik bir etüvde (3.7) ısıtılır. Soğutulduktan sonra,
15 dakika süre ile solvanla şartlandırılmış (filtre kağıdı konmadan) tanka
(3.2) daldırılır. 15 cm’ye kadar yürütme solvanı (2.21) (toluen / aseton)
içerisinde yürütülür (Yaklaşık 80 dakika sürer). Plak soğuk hava
akımında kurutulur, ultraviyole (3.3) altında incelenir. Zayıf lekelerin
floresansını arıttırmak için plak sıvı parafin / n-hekzan (2.22) karışımına
daldırılabilir. 5.
TANIM Her
leke için Rf hesaplanır. Ultraviyole ışığı
altında örnek ve referans solüsyonların Rf değerleri karşılaştırılır. Mevcut koruyucuların
varlığı ve niceliği araştırılır. Bölüm B’de tanımlanan HPLC uygulanır veya
eğer propiyonik asid’in mevcudiyeti görünüyorsa Bölüm C’de tanımlanan GC
uygulanır. Alıkonma süreleri referans solüsyonlarla karşılaştırılır. TLC ve HPLC veya
GC’den alınan sonuçlar birleştirilir. Toplam sonuçlar örnekte var olan
koruyucuların kesin teşhisleridir. B. BENZOİK ASİT,
4-HİDROKSİBENZOİK ASİT, SORBİK ASİT VE SALİSİLİK ASİT TAYİNİ 1. PRENSİP Asitleştirmeden sonra,
örnek, etanol ve su karışımı ile ekstre edilir. Süzülme işleminden sonra
koruyucular yüksek basınçlı sıvı kromatografi (HPLC) ile tayin edilir. 2. REAKTİFLER 2.1. Bütün çözeltiler
analitik saflıkta olmalı ve HPLC için uygun olmalıdır. Kullanılan su
damıtılmış olmalı yada eşdeğer saflıkta olmalıdır. 2.2.
Absolu etanol 2.3.
4-hidroksi benzoik asit 2.4.
Salisilik asit 2.5.
Benzoik asit 2.6.
Sorbik asit 2.7.
Sodyum asetat (CH4COONa.3H2O) 2.8.
Asetik asit (d420= 1.05 g/ml) 2.9.
Asetonitril 2.10.
Sülfürik asit, 2 M 2.11.
Sulu potasyum hidroksit 0.2 M 2.12.
2-metoksibenzoik asit 2.13.
Etanol / su karışımı Dokuz hacim etanol
(2.2), bir hacim su ile karıştırılır (2.1). 2.14.
İnternal standart solüsyonu 500 ml.lik etanol / su
karışımında (2.13) yaklaşık 1 gr 2-metoksi benzoik asit (2.12) ihtiva eden
bir solüsyon hazırlanır. 2.15.
HPLC için mobil faz 2.15.1.
Asetat tampon: 1 litrelik suya 6.35 gr
sodyum asetat (2.7) ve 20 ml asetik asit (2.8) ilave edilir ve karıştırılır. 2.15.2.
Dokuz hacim asetat tamponu (2.15.1) ve bir hacim
asetonitril (2.9) karıştırılarak mobil faz hazırlanır. 2.16.
Koruyucu stok solüsyonu Yaklaşık 0.05 g
4-hidroksibenzoik asit (2.3), 0.2 g salisilik asit (2.4), 0.2 g benzoik asit
(2.5) ve 0.05 g sorbik asit (2.6) 50 ml.lik ölçülü balona tam tartılır.
Etanol / su karışımı (2.13) ile hacme tamamlanır. Bu solüsyon buzdolabında
saklanır. Bir hafta süreyle stabildir. 2.17.
Koruyucu standart solüsyonları 20 ml.lik bir seri
ölçülü balon içerisine 8.00, 4.00, 2.00, 1.00 ve 0.50 ml stok solüsyon (2.16)
pipetlenir. Her bir ölçülü balon içerisine 10 ml internal standart solüsyon
(2.14) ve 0.5 ml sülfürik asit 2 M (2.10) konulur. Etanol / su karışımı
(2.13) ile hacme tamamlanır. Bu solüsyonlar taze hazırlanmalıdır. 3.
EKİPMAN Aksi belirtilmedikçe
normal laboratuvar düzeneği 3.1.
Su banyosu 60oC’ye ayarlanmış 3.2.
Yüksek basınçlı sıvı kromatografi, değişken dalga boylu UV
dedektörlü ve 10 µl enjeksiyon luplu. 3.3.
Analitik kolonu : Paslanmaz çelik Uzunluk : 12.5-25 cm İç çap : 4.6 mm, Nucleosil 5C18; veya eşdeğeri ile
doldurulmuş. 3.4.
Filtre kağıdı Çap: 90 mm Scleicher
ve Schull, Weissband No 5892 veya eşdeğeri 3.5.
50 ml cam tüpler, vidalı kapaklı 3.6.
5 ml cam örnek şişeleri 3.7.
Cam boncuklar 2-4 mm ebadında veya eşdeğeri 4.
İŞLEM 4.1.
Örnek hazırlanması 4.1.1.
İnternal standart eklemeden örnek hazırlama 50 ml.lik vidalı
kapaklı cam tüp (3.5) içine 1 g örnek tartılır. Sülfürik asit 2 M (2.10) ve
40.0 ml etanol / su karışımı (2.13) pipetlenir. Cam boncuklarından (3.7) 1 g
civarında eklenir. Tüp kapatılır ve homojen bir süspansiyon elde edilinceye
kadar en az bir dakika boyunca şiddetle çalkalanır. Etanol fazına
koruyucuların geçmesini kolaylaştırmak için tüp tam olarak 5 dakika 60oC
ısıdaki su banyosuna (3.1) konulur. Tüp hemen soğuk su
altına tutularak soğutulur ve ekstrakt 5oC’de 1 saat saklanır. Elde edilen ekstrakt
filtre kağıdından (3.4) süzülür. Filtre edilen üründen yaklaşık 2 ml örnek
şişesine (3.6) aktarılır. Filtrat 5oC’de bekletilir ve 24 saat
içinde HPLC ile tayin edilir. 4.1.2.
İnternal standart eklenerek örnek hazırlama 50 ml.lik vidalı
kapaklı cam tüp (3.5) içerisine örnek 1 ± 0.1 gr (A gram) tartılır. 1 ml 2 M
Sülfürik asit (2.10) ve 30 ml etanol / su karışımı (2.13) pipetle ilave
edilir. Yaklaşık 1 gr cam boncuk (3.7) ve 10 ml internal standart solüsyonu
(2.14) eklenir, tüpün ağzı kapatılır ve homojen bir süspansiyon elde
edilinceye kadar en az 1 dakika şiddetle çalkalanır. Koruyucuların etanol
fazına geçişini kolaylaştırmak için, tüp 5 dakika 60oC’deki su
banyosuna (3.1) yerleştirilir. Tüp hemen soğuk su
altında soğutulur ve ekstrakt 5oC’de 1 saat saklanır. Ekstrakt filtre
kağıdından (3.4) süzülür. Yaklaşık 2 ml filtrat örnek şişesine (3.6)
aktarılır. Filtrat 5oC’de saklanır ve 24 saat içerisinde HPLC ile
tayin yapılır. 4.2.
Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi Mobil faz : Asetonitril / asetat tamponu (2.15) Akış hızı : 2 ± 0.5 ml/dak. Dalga boyu : 240 nm 4.2.1.
Kalibrasyon Koruyucu standart
solüsyonlarının (2.17) her birinden 10’ar µl enjekte edilir. Kromatogramdan
her solüsyona karşı gelen pik yüksekliğinin internal standardın pik
yüksekliğine oranı tayin edilir ve her standart solüsyonun konsantrasyonuna
karşı grafiğe geçirilir. Grafikten lineer bir
sonuç çıkması gereklidir. 4.2.2.
Tayin Örnek
ekstraktından (4.1.1) 10 µl enjekte edilir. Kromatogram kaydedilir. Koruyucu
standart solüsyonundan (2.17) 10 µl enjekte edilir, kromatogram kaydedilir.
Elde edilen kromatogramlar karşılaştırılır. Eğer örnek ekstraktının (4.1.1)
kromatogramında 2-metoksibenzoik aside (önerilen internal standart) karşı
gelen alıkonma süresinde bir pik mevcut değilse 10 µl internal standart ilave edilmiş örnek
ekstraktı (4.1.2) enjekte edilir ve kromatogram kaydedilir. Eğer örnek ekstraktı
(4.1.1) kromatogramında 2-metoksibenzoik asit ile aynı alıkonma süresinde
başka bir pik görünürse uygun başka bir internal standart seçilmelidir. (Eğer koruyuculardan biri kromatogramda
mevcut değil ise bu koruyucu internal standart olarak kullanılabilir) Standart solüsyondan
ve örnek solüsyonundan elde edilen kromatogramların aşağıdaki gereklilikleri
sağladıklarından emin olunmalıdır.
P=f/g
Şekil 1: Pik ayırımı
Şekil 2: Pik asimetri
faktörü AS = h a
5.
HESAPLAMA Daha önce sözü edilen
kalibrasyon grafiğinden örnek solüsyondaki koruyucuların konsantrasyonları
hesaplanır. Örnekteki benzoik asit 4-hidroksibenzoik asit, sorbik asit veya
salisilik asit miktarı % kütle olarak (Xi) aşağıdaki formül
kullanılarak hesaplanır. Xi %
(m/m) = 100
x 20 x b = ___b____ 106 x a 500 x a Burada: a
= Test miktarının (4.1.2)
gram cinsinden kütlesi b
= Kalibrasyon grafiğinden
elde edilen örnek ekstraktındaki (4.1.2) µg/ml olarak koruyucu
konsantrasyonu. 6. TEKRARLANABİLİRLİK (ISO NORM 5725) % 0.40’lık bir
4-hidroksibenzoik asit miktarı için aynı örnekteki iki paralel tayin sonucu
arasındaki fark % 0.035’i geçmemelidir. % 0.50’lik bir benzoikasit miktarı için aynı
örnekteki iki paralel tayin sonucu arasındaki fark % 0.050’yi geçmemelidir. % 0.50’lik bir
salisilik asit miktarı için aynı örnekteki iki paralel tayin sonucu
arasındaki fark % 0.045’i geçmemelidir. % 0.60’lık bir sorbik
asit miktarı için aynı örnekteki iki paralel tayin sonucu arasındaki fark %
0.035’i geçmemelidir. 7. UYARI 7.1
Ekstrakta ilave edilen
sülfürik asit miktarı sonuçların hassasiyeti açısından kritiktir. Çalışılan örnek
miktarı ve eklenen asit miktarı tarif edilen sınırlar içerisinde kalmalıdır. 7.2
Eğer
istenirse uygun bir koruyucu ön kolon kullanılabilir. C. PROPİYONİK
ASİT TAYİNİ
1. KAPSAM VE UYGULAMA ALANI Bu metod kozmetik
ürünlerde maksimum % 2 (m/m) konsantrasyona kadar propiyonik asit tayini için
uygundur. 2. TANIM Üründeki propiyonik
asit konsantrasyonu bu metodla % kütle (m/m) cinsinden ifade edilir. 3. PRENSİP Propiyonik asit
üründen ekstre edildikten sonra gaz kromatografisi ile internal standart
olarak 2-metilpropiyonik asit kullanılarak tayin edilir. 4.
REAKTİFLER Kullanılan tüm
çözeltiler analitik saflıkta olmalıdır. Distile su veya eşdeğer kalitede su
kullanılmalıdır. 4.1.
Etanol % 96 v/v 4.2.
Propiyonik asit 4.3.
2-metil propiyonik asit 4.4.
Ortofosforik asit % 10 (m/v) 4.5.
Propiyonik asit solüsyonu 1 gr (p gram)
propiyonik asit 50 ml etanol (4.1) içinde 4.6.
İnternal standart solüsyonu 1 gr (e gram) 2-metil
propiyonik asit 50 ml etanol (4.1) içinde 5.
EKİPMAN 5.1.
Genel laboratuvar ekipmanları 5.2.
Alev iyonizasyon dedektörlü gaz kromatografi cihazı 5.3.
Vidalı kapaklı cam tüp (20 x 150 mm) 5.4.
60oC’de su banyosu 5.5.
Membran filtreli (0.45 µm) 10 ml.lik cam şırınga 6.
İŞLEM 6.1.
Örnek hazırlama 6.1.1.
İnternal standart koymadan örnek hazırlama Bir cam tüpe (5.3)
yaklaşık 1 gr örnek, 0.5 ml fosforik asit (4.4) ve 9.5 ml etanol (4.1)
konulur. Tüp kapatılır ve
şiddetle çalkalanır. Eğer gerekiyorsa lipid fazın tamamen çözünmesi için tüp
5 dakika 60oC’deki su banyosuna (5.4) yerleştirilir. Hızlıca su
altında soğutulur. Solüsyonun bir kısmı membran filtreden (5.5) süzülür.
Filtrat aynı gün kromatograflanır. 6.1.2.
İnternal standart ilave ederek örnek hazırlama 1 ± 0.1 gr (a gram)
örnek bir cam tüpe (5.3) tartılır. 0.5 ml fosforik asit (4.4), 0.50 ml
internal standart solüsyonu (4.6) ve 9 ml etanol (4.1) ilave edilir. Tüp kapatılır ve
şiddetle çalkalanır. Eğer gerekiyorsa lipid fazı çözmek için tüp 5 dakika 60oC’deki
su banyosuna (5.4) yerleştirilir. Su altında hızla soğutulur. Solüsyonun bir
kısmı membran filtreden (5.5) süzülür, aynı gün kromatograflanır. 6.2.
Gaz kromatografi şartları Aşağıdaki operasyon
şartları önerilir. Kolon Tip : Paslanmaz çelik Uzunluk : 2 m Çap : 1/8” Ambalaj : %
10 SPTM 1000 (veya eşdeğeri) + % 1 H3PO4 Chromosorb
WAW 100-120 mesh Sıcaklıklar Enjektör : 200oC Kolon : 120oC Dedektör : 200oC Taşıyıcı Gaz : Azot Akış hızı :
25 ml/dakika 6.3.
Kromatografi 6.3.1.
Kalibrasyon Bir seri 20 ml ölçülü balona
0.25, 0.50, 1.00, 2.00 ve 4.00 ml propiyonik asit solüsyonu (4.5) pipetlenir.
Balonlara 1’er ml’de internal standart solüsyon (4.6) pipetlenir. Balonlar
etanol (4.1) ile hacme tamamlanır ve karıştırılır. Bu şekilde hazırlanan
solüsyonlar e mg/ml 2-metilpropiyonik asit internal standardı içerirler (e=
1000 ise 1 mg/ml’dir.) ve p/4, p/2, p, 2p, 4p mg/ml propiyonik asit (Eğer p=
1000 ise 0.25, 0.50, 1.00, 2.00, 4.00 mg/ml demektir). Her solüsyondan 1’er
µl enjekte edilip, propiyonik asit / 2-metilpropiyonik asit kütle oranları
“x” ekseninde ve piklerin oranları “y” ekseninde olmak üzere kalibrasyon
eğrisi çizilir. Ortalama pik alan
oranlarını hesaplamak için her solüsyondan 3’er enjeksiyon yapılır. 6.3.2.
Tayin Filtre edilmiş örnekten
(6.1.1) 1 µl enjekte edilir. Kromatogramı, standart solüsyonun (6.3.1)
kromatogramı ile karşılaştırılır. Eğer bir pik 2-metil propiyonik asit ile
aşağı yukarı aynı alıkonma zamanına sahip ise internal standardı
değiştirilir. Eğer herhangi bir etkileşim görülmüyor ise 1 µl.lik filtre
edilmiş örnekten (6.1.2) enjeksiyon yapılarak, propiyonik asit ve internal
standardın pik alanları ölçülür. Her solüsyondan 3
enjeksiyon yapılarak ortalama pik alan oranı hesaplanır. 7.
HESAPLAMA 7.1.
6.3.1.’de elde edilmiş olan kalibrasyon eğrisiden
6.3.2’den hesaplanmış olan pikin alan oranına karşı gelen kütle (K) oranı
elde edilir. 7.2.
Yukarıdaki şekilde elde edilen kütle oranından örnekteki
(X) propiyonik asit miktarı % kütle cinsinden aşağıdaki formülle hesaplanır. X % (m/m) =
K 0.5 x
100 x e
= K _e_ 50
x a
a Burada: K
= 7.1’de hesaplanmış olan
oran e
= İnternal standardın (4.6)
gram olarak kütlesi a
= Örneğin (6.1.2) gram olarak
kütlesi 8. TEKRARLANABİLİRLİK (ISO NORM 5725) % 2’lik (m/m)
propiyonik asit miktarı için, aynı örnek üzerinde paralel olarak yapılan iki
deney sonucu arasındaki fark % 0.12’yi geçmemelidir. YÖNTEM II- KOZMETİK ÜRÜNLERDE
HİDROKİNON, HİDROKİNON MONOMETİLETER, HİDROKİNON MONOETİLETER VE HİDROKİNON
MONOBENZİLETER TANI VE TAYİNİ A. TANIM 1. KAPSAM VE UYGULAMA ALANI Bu
metod kozmetik ürünler arasında cilt beyazlatılmasında kullanılan ürünlerde
hidrokinon, hidrokinon monometileter, hidrokinon monoetileter ve hidrokinon
monobenzileter (monobenzon) tanı ve tayinini kapsar. 2. PRENSİP Hidrokinon ve onun
eterleri ince tabaka kromatografisi (TLC) ile tanımlanır. 3. REAKTİFLER Kullanılan bütün çözeltiler
analitik saflıkta olmalıdır. 3.1.
Etanol % 96 (v/v) 3.2.
Kloroform 3.3.
Dietil eter 3.4.
Yürütme solvanı Kloroform /
Dietileter, 66:33 (v/v) 3.5.
Amonyak, % 25 (m/m) (d420 = 0.91
g/ml) 3.6.
Askorbik asit 3.7.
Hidrokinon 3.8.
Hidrokinon monometileter 3.9.
Hidrokinon monoetileter 3.10.
Hidrokinon monobenzileter (monobenzon) 3.11.
Referans solüsyonlar Aşağıdaki referans
solüsyonlar günlük hazırlanmalıdır ve bir gün stabildirler. 3.11.1.
10 ml.lik dereceli tüpe 0.05 g hidrokinon (3.7) tartılır.
Üzerine 0.250 g askorbik asit (3.6) ve 5 ml etanol (3.1) ilave edilir.
Amonyak (3.5) ile pH 10’a ayarlanır. Etanol (3.1) ile hacme tamamlanır. 3.11.2.
10 ml.lik dereceli tüpe 0.05 g hidrokinon monometileter
(3.8) tartılır. Üzerine 0.250 g askorbik asit (3.6) ve 5 ml etanol (3.1)
eklenir. Amonyak (3.5) ile pH 10’a ayarlanır. Etanol (3.1) ile hacme
tamamlanır. 3.11.3.
10 ml.lik dereceli tüpe 0.05 g hidrokinon monoetileter
(3.9) tartılır. Üzerine 0.250
g askorbik asit (3.6) ve 5 ml etanol (3.1) eklenir. Amonyak (3.5) ile pH 10’a
ayarlanır. Etanol (3.1) ile hacme tamamlanır. 3.11.4.
10 ml.lik dereceli tüpe 0.05 g hidrokinon monobenzileter
(3.10) tartılır. Üzerine 0.250 g askorbik asit (3.6) ve 5 ml etanol (3.1)
eklenir. Amonyak (3.5) ile pH 10’a ayarlanır. Etanol (3.1) ile hacme
tamamlanır. 3.12.
Gümüş nitrat 3.13.
12-molibdofosforik asit 3.14.
Potasyum ferrisiyanür hekzahidrat 3.15.
Ferri klorür, hekzahidrat 3.16.
Sprey reaktiflerleri 3.16.1.
% 5’lik sulu gümüş nitrat (3.12) solüsyonuna oluşan
çökelek çözününceye kadar amonyak (3.5) ilave edilir. Dikkat: Solüsyon bekletildiğinde stabil
olmadığından patlama riski vardır. Kullanıldıktan sonra atılmalıdır. 3.16.2.
% 10’luk (m/v) 12-molibdofosforik asidin (3.13) etanol
(3.1) içindeki solüsyonu 3.16.3.
% 1’lik (m/v) potasyum ferrisiyanür (3.14) ve % 2’lik
(m/v) ferri klorür (3.15) sulu solüsyonları hazırlanır. Kullanmadan önce bu
solüsyonlar eşit hacimde karıştırılır. 4.
DÜZENEK Normal laboratuvar
ekipmanları 4.1.
Genel TLC düzenekleri 4.2.
TLC hazır plak; silika jel GHR / UV254;
20 x 20 cm (Machery, Nagel veya eşdeğeri) kaplama kalınlığı 0.25 mm 4.3.
Ultrasonik banyo 4.4.
Santrifüj 4.5.
UV lamba, 254 nm 5.
İŞLEM 5.1.
Örnek hazırlama 10 ml.lik ölçülü tüp
içine 3 g örnek tartılır. Üzerine 0.250 g askorbik asit (3.6) ve 5 ml etanol
(3.1) eklenir. PH, amonyak (3.5) ile 10’a ayarlanır. Etanol (3.1) ile hacme
tamamlanır. Tüp kapatılır ve ultrasonik banyoda 10 dakika homojen hale
getirilir. 3000 dev/dak.’da santrifüjlenir veya süzgeç kağıdından süzülür. 5.2.
TLC 5.2.1.
Kromatografi tankı, yürütme solvanı (3.4) ile doyurulur. 5.2.2.
Plağa referans solüsyondan (3.11) 2 µl ve örnek
solüsyondan (5.1) 2 µl uygulanır. Karanlıkta ve oda ısısında 15 cm yürütülür.
5.2.3.
Tanktan çıkartılan plak oda sıcaklığında kurutulur. 5.3.
Tespit 5.3.1.
Plak 254 nm UV ışığı altında incelenir ve noktaların
yerleri işaretlenir. 5.3.2.
Plak spreylenir: - Gümüş nitrat reaktifi (3.16.1) veya -
12-molibdofosforik asit reaktifi (3.16.2), yaklaşık 120oC’ye
kadar ısıtılır veya - Potasyum ferrisiyanür solüsyonu veya ferri
klorür solüsyonu (3.16.3) 6.
TANI Her nokta için Rf
değerleri hesaplanır. Örnek solüsyon noktaları
ile referans solüsyon noktalarının Rf’leri UV ışığı altındaki renkler
açısından ve püskürtme reaktifi ile belirgin hale gelen noktaların renkleri
açısından karşılaştırılır. Bundan sonraki kısımda
(B) tarif edilen HPLC uygulanır. Örnek pikleri ile referans solüsyon
piklerinin alıkonma süreleri karşılaştırılır. Hidrokinon ve / veya
eterlerinin varlığını saptamak için TLC ve HPLC’nin sonuçları birleştirilir. 7.
UYARI Belirtilen şartlar
altında aşağıdaki Rf değerleri gözlenmiştir. Hidrokinon 0.32 Hidrokinon
monometileter 0.53 Hidrokinon
monoetileter 0.55 Hidrokinon
monobenzileter 0.58 B. TAYİN
1. KAPSAM VE UYGULAMA ALANI Bu metod kozmetik
ürünler arasında cilt beyazlatılmasında kullanılan ürünlerde hidrokinon,
hidrokinon monometileter, hidrokinon monoetileter, hidrokinon monobenzileter
tayinini kapsar. 2. PRENSİP Örnek içindeki lipid
maddeleri eritmek için su / metanol karışımı ile ekstre edilir. Elde edilen
solüsyondan maddeler ters faz likit kromatografi ile UV saptaması yolu ile
yapılır. 3. REAKTİFLER 3.1. Bütün çözeltiler
analitik saflıkta olmalı, kullanılan su distile edilmiş olmalı veya aynı
derecede saf su kullanılmalıdır. 3.2.
Metanol 3.3.
Hidrokinon 3.4.
Hidrokinon monometileter 3.5.
Hidrokinon monoetileter 3.6.
Hidrokinon monobenzileter (monobenzon) 3.7.
Tetrahidrofuran, HPLC kalitede 3.8.
Su / metanol karışımı 1:1 (v/v): Bir hacim su ile bir
hacim metanol (3.2) karıştırılır. 3.9.
Mobil faz: Tetrahidrofuran / su karışımı 45:55
(v/v). 45 hacim tetrahidrofuran (3.7) ve 55 hacim su ile karıştırılır. 3.10.
Referans solüsyon: 0.06 g hidrokinon
(3.3), 0.08 g hidrokinon monometileter (3.4), 0.10 g hidrokinon monoetileter
(3.5) ve 0.12 g hidrokinon monobenzileter (3.6), 50 ml.lik ölçülü balona
tartılır. Metanol (3.2) ile çözülerek hacme tamamlanır. Bu solüsyonun 10
ml.si, 50 ml’ye su / metanol karışımı (3.8) ile seyreltilerek referans
solüsyon hazırlanır. Bu solüsyonlar taze hazırlanmalıdır. 4.
EKİPMAN Normal laboratuvar
ekipmanları 4.1.
60oC’de su banyosu 4.2.
Değişken dalga boylu UV dedektörlü 10 µl enjeksiyon luplu
yüksek basınçlı sıvı kromatografisi 4.3.
Analitik kolon Paslanmaz çelikten
kromatografik kolon; Uzunluk : 250 mm İç çap : 4.6 mm Zorbax fenil (kimyasal
bağlı feniletilsilan Zorbax SIL, trimetilklorosilan “end capped”) partikül büyüklüğü 6 µm veya
eşdeğeri Fenil veya eşdeğeri
hariç başka bir ön kolon kullanılmaz. 4.4.
Filtre kağıdı, çap 90 mm, Schleicher and Schull, Weissband
No 5892 veya eşdeğeri 5.
İŞLEM 5.1.
Örnek hazırlanması 1 ± 0.1 g (a gram)
sıfırdan sonra üç haneye kadar örnek 50 ml.lik ölçülü balona tartılır. Örnek
25 ml su / metanol (3.8) karışım içinde dağıtılır. Balon kapağı kapatılır ve
en az bir dakika homojen süspansiyon elde etmek için şiddetle çalkalanır. 60oC’deki
su banyosu (4.1) içine yerleştirilir. Daha sonra su banyosundan çıkartılan
balon soğutulur. Su / metanol (3.8)
karışımı ile hacme tamamlanır. Filtre kağıdından (4.4) süzülür. 24 saat
içinde HPLC’ye uygulanır. 5.2.
Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi 5.2.1.
Mobil faz (3.9) akış hızı: 1 ml / dakika Dedektör dalga boyu:
295 nm 5.2.2.
5.1’de elde edilen örnek solüsyondan 10 µl enjekte edilir,
kromatogram kaydedilir. Pik alanları ölçülür. 5.2.3’de belirtildiği şekilde
kalibrasyon eğrisi çizilir. Örnek ve standart solüsyondan elde edilen
kromatogramlar karşılaştırılır. 5.2.3’te hesaplanmış cevap faktörleri ve pik
alanları kullanılarak örnek çözeltideki bileşenlerin konsantrasyonları
hesaplanır. 5.2.3.
Kalibrasyon Referans
solüsyondan (3.10) 10 µl enjekte edilir ve kromatogram kaydedilir. Sabit bir
pik alanı elde edinceye kadar enjeksiyon işlemi birkaç kez tekrar edilir. Cevap faktörü RFi
tayin edilir. RFi = pi
Burada: pi
= Hidrokinon, hidrokinon monometileter, hidrokinon monoetileter veya
Hidrokinon monobenzileter’in pik alanları ci
= Hidrokinon, hidrokinon monometileter, hidrokinon monoetileter,
hidrokinon
monobenziletere ait referans solüsyon (3.10) içindeki konsantrasyonu
(g / 50 ml) Standart solüsyon ve
örnek solüsyon için elde edilen kromatogramların aşağıdaki şartları yerine
getirip getirmediğinden emin olunur. - En kötü ayrılmış pik çiftinin ayrılması en
az 0.90 olmalıdır. (Pik ayırımı tanımı için şekil 1’e bakınız.)
p = f Şekil 1: Pik ayırımı
g __Eğer istenen ayırım
elde edilmemişse ya daha etkili bir kolon kullanılır yada ayırım elde
edilinceye kadar mobil fazın bileşimi ayarlanır. - Elde edilen tüm
piklerin asimetri faktörü As 0.9 – 1.5 arasında olmalıdır. (Pik
asimetri faktör tanımı için şekil 2’ye bakınız.) Asimetri faktör tayini için
kromatogram kaydedilirken kağıt hızının en az 2 cm / dakika olması önemlidir. As = h
Şekil 2: Pik asimetri
faktörü 6.
HESAPLAMA Örnek içindeki
maddelerin konsantrasyonlarını hesaplamak için bileşenlerin piklerinin
alanları kullanılır. Bileşen konsantrasyonları aşağıdaki formül kullanılarak yüzde kütle
olarak (xi) hesaplanır. xi % (m/m)
= bi x 100 RFi x a Burada: a
= Örneğin gram olarak kütlesi bi
= Örnek içindeki bileşenlerin
pik alanı 7. TEKRARLANABİLİRLİK (ISO NORM 5725) 7.1.
% 2’lik bir hidrokinon miktarı için aynı örnek üzerinde
yapılan iki paralel tayin sonucu arasındaki fark % 0.13’ü geçmemelidir. 7.2.
% 1’lik bir hidrokinon monometileter miktarı için aynı
örnek üzerinde yapılan iki paralel tayin sonucu arasındaki fark % 0.1’i
geçmemelidir. 7.3.
% 1’lik bir hidrokinon monoetileter miktarı için aynı
örnek üzerinde yapılan iki paralel tayin sonucu arasındaki fark % 0.11’i
geçmemelidir. 7.4.
% 1’lik bir hidrokinon monobenzileter miktarı için aynı
örnek üzerinde yapılan iki paralel tayin sonucu arasındaki fark % 0.11’i geçmemelidir. 8. ÜRETİLEBİLİRLİK
(ISO
5725) 8.1 % 2’lik bir hidrokinon
miktarı için aynı örnek üzerinde değişik şartlarda (değişik laboratuvar,
değişik operatör, değişik cihaz ve /
veya değişik zamanlarda) yapılan iki farklı tayin değerlendirilir. Aradaki
fark % 0.37’i geçmemelidir. 8.2 % 1’lik bir hidrokinon
monometileter miktarı için aynı örnek üzerinde değişik şartlarda (değişik
laboratuvar, değişik operatör, değişik cihaz ve / veya değişik zamanlarda)
yapılan iki farklı tayin değerlendirilir. Aradaki fark % 0.21’i geçmemelidir. 8.3 % 1’lik bir hidrokinon
monoetileter miktarı için aynı örnek üzerinde değişik şartlarda (değişik
laboratuvar, değişik operatör, değişik cihaz ve / veya değişik zamanlarda)
yapılan iki farklı tayin değerlendirilir. Aradaki farkı % 0.19’u
geçmemelidir. 8.4 % 1’lik bir hidrokinon
monobenzileter miktarı için aynı örnek üzerinde değişik şartlarda (değişik
laboratuvar, değişik operatör, değişik cihaz ve / veya değişik zamanlarda)
yapılan iki farklı tayin değerlendirilir. Aradaki fark % 0.11’i geçmemelidir.
9. UYARI 9.1 Hidrokinon miktarı %
2’nin bir hayli üzerinde bulunması halinde ve doğru bir ayin yapılmak
isteniyor ise, elde edilmiş olan örnek ekstraktı (5.1)% 2’lik hidrokinon elde
edilmiş bir örneğinkine benzer şekilde seyreltilmelidir ve tayin
tekrarlanmalıdır. (Bazı cihazlarda yüksek konsantrasyonlarda
hidrokinon için dedektör cevabı doğrusallıktan sapabilir.) 9.2
Etkileşmeler Yukarıda tarif edilen
metod hidrokinon ve eterlerinin tek bir izokratik çalışmada tayinini
tanımlamaktadır. Fenil kolonunun kullanılması halinde hidrokinon için yeterli
tutulma (alıkonma zamanı) sağlanmaktadır. Bu durum tarifi yapılan mobil fazda
C18 kolonu kullanıldığında garanti edilmeyebilir. Bununla beraber bu
metod, parabenler tarafından oluşturulan etkileşmelere eğilim göstermektedir.
Bu durumlarda başka mobil faz veya faz sistemi ile tayin tekrarlanmalıdır.
Referans 1 ve referans 2’de uygun metodlar bulunabilir. Yani: Kolon : Zorbax ODS, 4.6 mm x 25 mm veya eşdeğeri Sıcaklık : 36oC Akış : 1.5 ml / dakika Mobil faz: Hidrokinon için : Metanol / su, 5: 95 (v/v) Hidrokinon
monometileter için : Metanol / su, 30:70 (v/v) Hidrokinon
monobenzileter için : Metanol / su, 80: 20 (v/v) Kolon : Spherisorb S5 – ODS veya
eşdeğeri Mobil faz : Su / metanol 90: 10 (v/v) Akış : 1.5 ml / dakika Bu şartlar hidrokinon
için uygundur. |