|
Tebliğ Sağlık
Bakanlığından: Kozmetik Ürün
Bileşimlerinin Kontrolü İçin Gerekli Analiz
Yöntemleri Hakkında Tebliğ Tebliğ
No:İEG-2005/7
Amaç
Madde 1- Bu Tebliğin amacı, 2-fenoksietanol, 1-fenoksipropan-2-ol,
metil, etil, propil, butil
ve benzil, 4-hidroksibenzoat
tanı ve tayini konularındaki analiz
yöntemleri ile ilgili usul ve esasları
belirlemektir. Kapsam
Madde 2-
Bu Tebliğ, aşağıdaki analiz metodlarının
uygulamalarını kapsar: 2-fenoksietanol,
1-fenoksipropan-2-ol, metil, etil, propil, butil ve benzil 4-hidroksibenzoat
tanı ve tayini Ek’teki yönteme göre yapılır. Hukuki Dayanak
Madde 3 - Bu Tebliğ, 23/5/2005
tarihli ve 25823 sayılı Resmi Gazete’de yayımlanan Kozmetik Yönetmeliği’nin
16 ncı maddesine dayanılarak hazırlanmıştır. Uyumlaştırılan Avrupa Birliği Mevzuatı Madde 4- Bu
Tebliğ, 96/45/EEC sayılı Kozmetik Ürün Bileşimlerinin Kontrolü İçin Gerekli Analiz Yöntemleri Hakkında Yedinci Komisyon
Direktifi dikkate alınarak Avrupa Birliği mevzuatına uyum kapsamında hazırlanmıştır.
Bu Tebliğ, laboratuarların denenmiş ve bilimsel geçerliliği olan yöntemleri
kullanmasını engellemez. Yürürlük Madde 5-
Bu Tebliğ yayımı tarihinde yürürlüğe girer. Yürütme Madde 6- Bu
Tebliğ hükümlerini Sağlık Bakanı yürütür. EK YÖNTEM – KOZMETİK
ÜRÜNLERDE, 2-FENOKSİETANOL, 1-FENOKSİ- PROPAN-2-OL, METİL, ETİL, PROPİL,
BUTİL VE BENZİL
4-HİDROKSİBENZOAT TANI VE TAYİNİ
A. TANI 1. KAPSAM VE UYGULAMA ALANI Bu metod
kozmetik ürünlerde, 2-fenoksietanol, 1-fenoksipropan-2-ol, metil 4-hidroksibenzoat,
etil 4-hidroksibenzoat, propil
4-hidroksibenzoat, butil 4-hidroksibenzoat
ve benzil 4-hidroksibenzoat’ın
tanısına olanak sağlayan, “B” bölümünde belirtilen analiz metodu ile
bağlantılı ince tabaka kromatografisi (TLC)
prosedürünü tanımlar. 2. PRENSİP Koruyucular, asitlendirilmiş kozmetik örnekten aseton ile ekstre edilir. Süzüldükten sonra, aseton solüsyonu su ile
karıştırılır ve alkali ortamda yağ asitleri kalsiyum tuzları olarak
çöktürülür. Alkali aseton / su karışımı, lipofilik
maddeleri uzaklaştırmak için dietileter ile ekstre edilir. Asitlendirildikten
sonra koruyucular dietileter ile ekstre edilir. Dietileter ekstraktı silikajel kaplı ince
tabaka plağına damlatılır. Plak yürütüldükten sonra kromatogram
UV ışığı altında gözlenir ve Millon’s reaktifiyle
görünür hale getirilir. 3. REAKTİFLER 3.1.
Genel Tüm
çözeltiler analitik saflıkta olmalı ve kullanılan su, distile
su veya eşdeğer kalitede olmalıdır. 3.2.
Aseton 3.3.
Dietileter 3.4.
n-pentan 3.5.
Metanol 3.6.
Glasial asetik asit 3.7.
Hidroklorik asit solüsyonu, c(HCl)
= 4 mol / lt 3.8.
Potasyum hidroksit solüsyonu c(KOH) = 4 mol / lt 3.9.
Kalsiyum klorür dihidrat (CaCl2.2H2O) 3.10.
Belirleme reaktifi: Millon’s
reaktifi Millon’s reaktifi (Merküri (II) nitrat) piyasada satışa hazır bir
solüsyondur (Fluka 69820). 3.11.
2-fenoksietanol 3.12.
1-fenoksipropan-2-ol 3.13.
Metil 4-hidroksibenzoat (metilparaben) 3.14.
Etil 4-hidroksibenzoat (etilparaben) 3.15.
n-propil 4-hidroksibenzoat
(propilparaben) 3.16.
n-butil 4-hidroksibenzoat
(butilparaben) 3.17.
Benzil 4-hidroksibenzoat
(benzilparaben) 3.18.
Referans solüsyonlar 3.11,
3.12, 3.13, 3.14, 3.15, 3.16 ve 3.17 referans maddelerinin her birinin % 0.1
(m/v) metanol içindeki solüsyonları hazırlanır. 3.19.
Tank solvanı 88
hacim n-pentan (3.4) ile 12 hacim glasiyal asetik asit (3.6) karıştırılır. 4. EKİPMAN Normal laboratuvar ekipmanı ve: 4.1.
60oC’lik ısı elde etmeye yeterli su banyosu 4.2.
Yürütme tankı (kağıt-filtresiz) 4.3.
Ultraviyole ışık kaynağı, 254 nm 4.4.
Konsantrasyon alanı ile 0.25 mm’lik
60 F254, silikajel ile kaplanmış, 20 cm
x 20 cm.lik ince tabaka plakları (Merck No: 11798, Darmstadt veya eşdeğeri) 4.5.
105oC’ye kadar ısı elde etmeye yeterli etüv 4.6.
Kurutma makinası (sıcak) 4.7.
Yün boya rulosu yaklaşık uzunluk : 10 cm, dış çap : 3.5
cm, yün tabakanın kalınlığı : 2 ile 3 mm olacaktır. Gerektiğinde yün
inceltilebilir. 5.2
notuna bakınız. 4.8.
Vidalı kapaklı 50 ml cam tüp 4.9.
Elektrikli ısıtıcı tabla termostatlı, Isı ayarı: yaklaşık
80oC. Sıcak tabla 20 x 20
cm ebadında ve sıcaklığın eşit şekilde dağılmasını sağlamak için yaklaşık 6
mm kalınlığında alüminyum plak ile kaplanmış olacaktır. 5.
İŞLEM 5.1.
Örnek hazırlanması 1
gr örnek 50 ml vidalı kapaklı cam tüp (4.8) içine tartılır. Üzerine dört
damla hidroklorik asit solüsyonu (3.7) ve 40 ml aseton konulur. Tuvalet sabunları gibi
kuvvetli bazik kozmetik ürünler için 20 damla hidroklorik asit solüsyonu
(3.7) ilave edilir. Tüp kapatılır. Aseton fazına koruyucuların ekstraksiyonlarını kolaylaştırmak için, karışım yaklaşık
60oC’lik ısıda ve bir dakika boyunca kuvvetli bir şekilde
çalkalanır. PH kağıdı
kullanılarak, solüsyonun pH’sı ölçülür, hidroklorik
asit solüsyonu ile pH < 3’e ayarlanır, kuvvetlice bir dakika
çalkalanır. Solüsyon oda
sıcaklığına kadar soğutulur. Filtre kağıdı ile erlene
süzülür. Bu süzüntünün 20 ml’si 200 ml.lik bir erlene transfer edilir.
Üzerine 60 ml su eklenir ve karıştırılır. PH indikatör
kağıdı kullanılarak potasyum hidroksit (3.8) solüsyonu ile pH 10 civarına ayarlanır. 1 gr kalsiyum klorür dihidrat (3.9) eklenir ve kuvvetli bir şekilde
çalkalanır. Solüsyon 75 ml dietileter içeren 250 ml’lik ayırma hunisi içine filtre kağıdından süzülür ve bir dakika
boyunca kuvvetlice çalkalanır. Fazlar ayrılmaya bırakılır. 200 ml.lik erlene sulu faz toplanır.
PH indikatör kağıdı kullanılarak hidroklorik asit
solüsyonu ile pH yaklaşık 2’ye ayarlanır. Daha
sonra 10 ml dietileter ilave edilir ve bir dakika
boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır. Fazlar ayrılmaya bırakılır. 5 ml.lik örnek şişesine yaklaşık 2 ml dietileter
fazı transfer edilir. 5.2.
İnce tabaka kromatografisi
(TLC) Isıtılmış
alüminyum plaka (4.9) üzerine TLC plağı (4.4) yerleştirilir. Referans
solüsyonları (3.18) her birinden 10 µl ve örnek solüsyondan (5.1) 100 µl TLC
plağının konsantrasyon alanına damlatılır. Eğer istenirse
buharlaşmayı kolaylaştırmak için hava akımı kullanılır. Plak ısıtılmış
plakadan alınır ve oda ısısına soğutulur. Tanka (4.2) 100 ml yürütme solvanı (3.19) aktarılır. Vakit geçirmeksizin
plak önceden doyurulmamış tankta 15 cm yürütülür. Tanktan çıkarılır ve sıcak
hava ile kurutulur. Plak UV ışığı (4.3)
altında incelenir ve lekelerin durumları işaretlenir. Fazla asetik asidi
elimine etmek için, plak 30 dakika 100oC ısıdaki etüv (4.5) içinde
ısıtılır. Millon’s reaktifi (3.10) yardımıyla bu
reaktif içine boyama rulosunu (4.7) daldırarak ve eşit şekilde nemlenmiş
oluncaya kadar TLC plağının üstünde çevirerek kromatogram
içindeki koruyucu lekelerinin görünür olması sağlanır. NOT: Alternatif olarak, UV ışığı altında, açığa
çıkan lekelerden her birinin üzerine dikkatli olarak bir damla millon’s reaktifi uygulanarak lekeler açığa
çıkarılabilir. 4-hidroksibenzoik
asit esterleri kırmızı lekeler, 2-fenoksietanol ve
1-fenoksipropan-2-ol esterleri sarı lekeler olarak
görünürler. Bununla birlikte, 4-hidroksibenzoik
asidin kendisi parabenlerin ayrıştırma ürünü veya
koruyucu olarak örnekte bulunuyorsa, kırmızı leke olarak açığa çıkar (Bakınız
7.3 ve 7.4). 6.
TANIMLAMA Her
leke için Rf değeri hesaplanır. Rf
değeri gözönüne alınarak referans solüsyonları ile
örnek solüsyonundan elde edilmiş lekeleri, UV ışığı altında ve lekelerin
açığa çıkarılmalarından sonraki renkleri karşılaştırılır. Koruyucuların
teşhisi hakkındaki ilk sonuçlar değerlendirilir. Eğer
parabenler mevcut ise, “B” bölümünde tanımlanan
HPLC (Yüksek basınçlı sıvı kromatografi) prosedürü uygulanmak
zorundadır. TLC kromatografisindeki ve yüksek
basınçlı sıvı kromatografisindeki (HPLC) sonuçlar
birleştirilerek 2-fenoksietanol, 1-fenoksipropan-2-ol ve parabenlerin
varlığı kanıtlanır. 7.
UYARILAR 7.1.
Millon’s reaktifinin toksik olması nedeniyle, bu reaktif tanımlanmış
prosedürlerden birine göre uygulanmak zorundadır. Spreyleme
tavsiye edilmez. 7.2.
Hidroksil grupları içeren diğer bileşikler aynı zamanda, millon’s reaktifi ile renklenebilirler. Renklerin tablosu
ve bu TLC prosedüründe kullanılan koruyucular
için elde edilmiş Rf değerleri aşağıdaki
yayınlarda bulunabilir. N. de Kruijf, M.A.H. Rijk, L.A. Pranto-Soeteardhi ve A. Schouten (1987):
Kozmetik ürünlerdeki koruyucuların tesbiti:
Kozmetik ürünlerdeki koruyucuların tanısı ince tabaka kromatografi
esesına dayanır (J. Chromatography 410, 395-411). 7.3.
Aşağıdaki tablo elde edilebilir Rf
değerlerinin listesini verir.
7.4.
4-hidroksibenzoik asit ve metilparaben için veya benzilparaben
ve etilparaben için ayrılma elde edilmemiştir. Bu
bileşiklerin tanımlanması, referans solüsyonları ve örnek solüsyonlarından
elde edilmiş retansiyon zamanlarını karşılaştırarak
bölüm B’de tanımlanan HPLC metodu uygulanarak
doğrulanabilir. B. TAYİN 1. KAPSAM VE UYGULAMA ALANI Bu metod
kozmetik ürünlerde 2-fenoksietanol, 1-fenoksipropan-2-ol, metil 4-hidroksibenzoat,
etil 4-hidroksibenzoat, propil
4-hidroksibenzoat, butil 4-hidroksibenzoat
ve benzil 4-hidroksibenzoat’ın
tayinini tanımlar. 2. TANIM Bu metoda göre
tanımlanan koruyucuların miktarı yüzde kütle cinsinden ifade edilir. 3. PRENSİP Sülfürik asit ile asitlendirilmiş örnek daha sonra etanol ve su karışımında
bekletilir. Ekstraksiyonu gerçekleştirmek için
ortamdaki lipid fazın erimesi karışım hafifçe
ısıtıldıktan sonra sağlanır ve süzülür. Süzüntüdeki mevcut
koruyucular internal standart olarak isopropyl 4-hidroksibenzoat
kullanarak ters faz HPLC ile belirlenebilir. 4. REAKTİFLER 4.1.
Genel Bütün
çözeltiler analitik saflıkta olmalı ve gerektiğinde HPLC için uygun olmalıdır.
Kullanılan su damıtılmış olmalı yada eşdeğer saflıkta olmalıdır. 4.2.
Absolu etanol 4.3.
2-Fenoksietanol 4.4.
1-Fenoksipropan-2-ol 4.5.
Metil 4-hidroksibenzoat (metilparaben) 4.6.
Etil 4-hidroksibenzoat (etilparaben) 4.7.
n-propil 4-hidroksibenzoat
(propilparaben) 4.8.
Isopropil 4-hidroksibenzoat
(isopropilparaben) 4.9.
n-butil 4-hidroksibenzoat
(butilparaben) 4.10.
Benzil 4-hidroksibenzoat
(benzilparaben) 4.11.
Tetrahidrofuran 4.12.
Metanol 4.13.
Asetonitril 4.14.
Sülfürik asit solüsyonu c(H2SO4) = 2
mol / lt 4.15.
Etanol / su karışımı Dokuz hacim etanol (4.2)
ve bir hacim su 4.16.
İnternal standart solüsyonu Yaklaşık
olarak tam tartılmış 0.25 g isopropilparaben (4.8),
500 ml.lik ölçülü balona alınır. Etanol / su
karışımı (4.15) ile çözülerek hacme tamamlanır. 4.17.
Mobil faz: Tetrahidrofuran
/ su / metanol / asetonitril
karışımı 5
hacim tetrahidrofuran, 60 hacim su, 10 hacim metanol ve 25 hacim asetonitril 4.18.
Koruyucu stok solüsyonu Yaklaşık
olarak tam tartılmış 0.2 g 2-fenoksietanol, 0.2 g
1-fenoksipropan-2-ol, 0.05 g metilparaben,
0.05 g etilparaben, 0.05 g propilparaben,
0.05 g butilparaben ve 0.025 g benzilparaben
100 ml.lik ölçülü balona aktarılır. Etanol / su
karışımı ile çözülür ve hacme tamamlanır. Solüsyon, bir hafta
buzdolabında stabil kalır. 4.19.
Standart koruyucu solüsyon Bir seri 50 ml.lik ölçülü balona stok solüsyondan (4.18) 20.00 ml, 10.00
ml, 5.00 ml, 2.00 ml ve 1.00 ml transfer edilir. Her balona 10 ml internal standart solüsyonu (4.16) ve 1 ml sülfürik asit
solüsyonu (4.14) eklenir ve etanol / su karışımı ile hacme tamamlanır. Bu
solüsyonlar taze hazırlanmalıdır. 5.
EKİPMAN Normal
laboratuvar ekipmanı ve: 5.1. 60oC ± 1oC’lik
ısı elde etmeye yeterli su banyosu 5.2.
Yüksek basınçlı sıvı kromatografi
cihazı: UV-dedektörlü, dalga boyu 280 nm. 5.3.
Analitik Kolon: Paslanmaz çelik, 25 cm
x 4.6 mm (veya 12.5 cm x 4.6 mm) Nucleosil 5C18 veya eşdeğeri (Bakınız 10.1) 5.4.
Vidalı kapaklı 100 ml.lik cam
tüpler 5.5.
Kaynamayı kolaylaştırmak için carborundum
parçaları, boyutları 2 ile 4 mm veya eşdeğeri 6.
İŞLEM 6.1.
Örnek hazırlama 6.1.1. İnternal
standart ilave edilmeden örnek hazırlama Yaklaşık olarak tam
tartılmış 1 g örnek vidalı kapaklı tüpe aktarılır. 1 ml sülfürik asit
solüsyonu (4.14) ve 50 ml etanol / su karışımı (4.15) ilave edilir. Yaklaşık
1 gr kaynatma parçası (5.5) eklenir, tüpün kapağı kapatılır, homojen bir süspansiyon
elde edilinceye kadar kuvvetli bir şekilde çalkalanır (En az bir dakika). Tüp
koruyucuların etanol fazına ekstraksiyonunu
kolaylaştırmak için 5 dakika süresince 60oC ± 1oC’lik
su banyosunda (5.1) tutulur. Tüp hemen soğuk su
altında soğutulur ve bir saat boyunca buzdolabında muhafaza edilir. Filtre
kağıdından süzülür. Yaklaşık 2 ml süzüntü 5 ml.lik
örnek şişesine transfer edilir. Süzüntüler buzdolabında muhafaza edilir ve 24
saat içinde HPLC’de tayin edilir. 6.1.2.
İnternal standart ilave ederek
örnek hazırlama Yaklaşık 1 g ± 0.1 g
örnek 100 ml.lik vidalı kapaklı cam tüpe tartılır. 1 ml sülfürik asit
solüsyonu ve 40 ml etanol / su karışımı tüpe pipetlenir.
Yaklaşık 1 g kaynatma parçası (5.5) ve tam olarak 10 ml internal
standart solüsyonu eklenir. Tüp kapatılır, homojen bir süspansiyon elde
edilinceye kadar şiddetle çalkalanır (En az 1 dakika). Tüp, koruyucuların
etanol fazına ekstraksiyonlarını kolaylaştırmak
için 5 dakika süresince 60oC ± 1oC’lik su banyosunda
bırakılır. Tüp hemen soğuk su
altında soğutulur ve 1 saat boyunca buzdolabında muhafaza edilir. Süzgeç
kağıdından süzülür. Yaklaşık 2 ml süzüntü
5 ml.lik örnek şişesine transfer edilir (Test
solüsyonu). Süzüntü buzdolabında muhafaza edilir ve 24 saat içinde HPLC’de tayin edilir. 6.2.
Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi
(HPLC) 6.2.1.
Kromatografik şartlar - Mobil faz :
Tetrahidrofuran / su / metanol
/ asetonitril karışımı (4.17) - Akış hızı :
1.5 ml / dakika - Dalga boyu :
280 nm 6.2.2.
Kalibrasyon Standart
koruyucu solüsyonların (4.19) her birinden 10 µl enjekte edilir. Buradan elde
edilen kromatogramlardan, koruyucu standart
solüsyonlarının pik yüksekliğinin internal standart
pik yüksekliğine oranı hesaplanır. Bu orana karşı koruyucu konsantrasyonlar
grafiğe geçirilir. 6.2.3.
Tayin Kromatografa, internal
standartsız 10 µl örnek solüsyon (6.1.1) enjekte edilir, kromatogram
kaydedilir. Koruyucu standart
solüsyonların (4.19) birinden 10 µl enjekte edilir ve kromatogram
kaydedilir. Elde edilen kromatogramlar
karşılaştırılır. Örnek ekstraktın (6.1.1) kromatogramında
hiçbir pikin isopropilparaben’-inkine
(önerilen internal standardı) yaklaşık aynı alıkonma zamanı göstermemesi durumunda, internal standart (6.1.2) içeren 10 µl örnek solüsyon
enjekte edilir. Kromatogram kaydedilir ve pik
yükseklikleri ölçülür. Örnek solüsyonun kromatogramında isopropilparabene
yaklaşık aynı alıkonma zamanına sahip pik
gözlenmesi durumunda, diğer bir internal standart
seçilmek zorundadır. İnceleme sırasında,
koruyuculardan birinin örnek solüsyonda olmaması durumunda, bu koruyucu
alternatif internal standart olarak kullanılabilir. Araştırılan
koruyucuların pik yüksekliklerinin internal
standart pik yüksekliğine oranları hesaplanır. Kalibrasyon prosedüründe
kullanılan standart solüsyonlar için lineer bir cevap elde edilmiş olmasından
emin olunmalıdır. Standart solüsyonlar
ve örnek solüsyonlar için elde edilmiş kromatogramların
aşağıdaki gerekliliklere uymasından emin olunmalıdır. -
En kötü ayrılmış pik çiftlerinin seperasyonu
en azından 0.90 olmak zorundadır (Pik seperasyonu
tanımı için şekil 1’e bakınız). Pik seperasyonu (p) p =
f/g
Şekil 1: Pik seperasyonu İstenilen seperasyona ulaşılmaması durumunda, ya
daha etkili kolon kullanılması veya özelliklere uygun oluncaya kadar mobil
faz oranlarının ayarlanması gerekli olacaktır. - Elde edilen tüm pikler için asimetri
faktörü As 0.9 ile 1.5 arasında
olacaktır (Pik asimetri faktörü tanımı için Şekil 2’ye bakınız).
Asimetri faktörü tayini için kromatogram
kaydedilirken, kağıt hızı en az 2 cm /
dakika olarak önerilmiştir. Asimetri faktörü (As) As = b/a
Şekil 2: Pik asimetri
faktörü - Sabit temel çizgi elde edilecektir. 7.
HESAPLAMA Kalibrasyon eğrisi (6.2.2) örnek
solüsyondaki koruyucuların konsantrasyonunun hesaplanması için kullanılır. 2-fenoksietanol, 1-fenoksipropan-2-ol, metil 4-hidroksibenzoat, etil 4-hidroksibenzoat,
propil 4-hidroksibenzoat,
butil 4-hidroksibenzoat
ve benzil 4-hidroksibenzoat
içerikleri, wi aşağıdaki formül
kullanılarak % ağırlık (% m/m) olarak hesaplanır: % wi
(m/m) = bi
Burada: bi :
Kalibrasyon eğrisinden okunan test
solüsyonundaki i koruyucu- sunun
konsantrasyonu (µg / ml) a
: Test miktarının kütlesi
(g) 8. TEKRARLANABİLİRLİK
(ISO
NORM 5725) Alıkonma süresi: r 10.5’deki
uyarılarak bakınız. 9. ÜRETİLEBİLİRLİK
(ISO
NORM 5725) (Pik
yüksekliği: R) 10.5’deki
uyarılara bakınız. 10.
UYARILAR 10.1
Sabit faz Maddelerin
alıkonma süreleri HPLC kolonunun tipine, markasına,
dolgu maddesine bağlıdır. Önerilen kolonlara alternatif olarak Hypersil ODS veya Zorbax ODS
kullanılabilir. Ayrıca önerilen mobil faz kompozisyonu uygun ayırım elde
edebilmek için değiştirilebilir. 10.2
Dalga boyu Dalga
boyunda küçük değişmeler bile tayinde belirgin değişikliğe neden olabilir. Bunun için analiz
süresince bu parametre kontrol edilmelidir. 10.3
Etkileşimler Tanımlanan
şartlarda başka maddeler de (kozmetik katkı maddeleri, koruyucular gibi)
kolonda sürüklenecektir. 10.4
Kolonu
korumak için uygun bir ön-kolon kullanılabilir. 10.5
Bu metod 9 laboratuvar arasında kollaboratif çalışmaya sunulmuş olup, aşağıdaki tablo her
3 örnek için % kütle cinsinden bileşenlerin “r” ve “R” değerlerini vermektedir.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
